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组织培养(tissue culture)技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分进行培养的技术。植物组织培养即植物无菌培养技术,又称离体培养,是根据植物细胞具有全能性的理论,利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下,能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根,最后形成完整的植株的学科。 



 组织培养类型


组织培养按培养对象可分为组织或愈伤培养、器官培养、植株培养、细胞和原生质体培养等。一是组织或愈伤组织培养tissue, callus culture为狭义的组织培养,是对植物体的各部分组织进行培养,如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等;或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养,二者均通过再分化诱导形成植株。二是器官培养organ culture即离体器官的培养,根据作物和需要的不同,可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。三是植株培养(plant culture是对完整植株材料的培养,如幼苗及较大植株的培养。四是细胞培养(cell culture是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。原生质体培养(protoplast culture)是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。



 组织培养特点


组织培养是本世纪发展起来的一门新技术,由于科学技术的进步,尤其是外源激素的应用,使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据,而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法,并在生产上越来越得到广泛的应用。一是培养条件可以人为控制。组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长,摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响,且条件均一,对植物生长极为有利,便于稳定地进行周年培养生产。二是生长周期短,繁殖率高。植物组织培养是由于人为控制培养条件,根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件,因此生长较快。另外,植株也比较小,往往20-30d为一个周期。所以,虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗,但由于植物材料能按几何级数繁殖生产,故总体来说成本低廉,且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。三是管理方便,利于工厂化生产和自动化控制。植物组织培养是在一定的场所和环境下,人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件,极利于高度集约化和高密度工厂化生产,也利于自动化控制生产。四是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动,可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。


 

 组织培养的发展

 

萌芽阶段:组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事,但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。20世纪初,在SchleidenSchwann所发展起来的细胞学说的推动下,1902年德国植物学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点,以及植物细胞全能性的理论,即植物的体细胞,在适当的条件下,具有不断分裂和繁殖,发育成完整植株的潜在能力。他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。1912年,Habefiandt的学生Kotte和美国的Robins根尖培养中获得了组织培养的成功。


奠基阶段:Haberlandt的实验之后,直到1934年美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系,并反复转移到新鲜培养基中继代培养,使根的离体培养实验获得了真正的成功,并在以后28年间培养了1600代。这之后,White又以小麦根尖为材料,研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响,并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基,其成分均为已知化合物,包括3B族维生素,即吡哆醇、硫胺素和烟酸,该培养基后来被定名为White培养基。与此同时,Gautherer1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中,提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义,并于1939连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。


发展阶段:1940年代Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现,腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用,而能诱导形成芽,从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。1952MorelMartin通过茎尖分生组织的离体培养,从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株。19351945Muir把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养,使细胞发生了分裂,即实施了看护接种技术,使单细胞培养获得初步成功。1960年,Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971年,Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株,这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性,而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。1962年印度Guha等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中,由花粉诱导得到单倍体植株,从而促进了花药和花粉培养的研究。以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得成功,其数目达到160多种,其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注目的成就。


 

 组织培养的过程


材料采集:组织培养所用的材料非常广泛,可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶,有时也利用花粉粒和花药,其中根尖不易灭菌,一般很少采用。 对于木本花卉来说,阔叶树可在一、二年生的枝条上采集,针叶树种多采种子内的子叶或胚轴,草本植物多采集茎尖。在快速繁殖中,最常用的培养材料是茎尖,通常切块在0.5厘米左右,如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分,其长度在0.1毫米以下。


材料消毒:先将材料用流水冲洗干净,最后一遍用蒸馏水冲洗,再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干,并用消毒刀片切成小块。 在无菌坏境中将材料放入70%洒精中浸泡3060秒。 再将材料移入漂白粉的饱和液或0.1%升汞水中消毒10分钟。 取出后用无菌水冲洗三、四次。 


制备外植体:将已消毒的材料,用无菌刀、剪、镊等,在无菌的环境下,剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等,叶片则不需剥皮。然后切成0.20.5厘米厚的小片,这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。

 

接种和培养:在无菌坏境下,将切好的外植体立即接在培养基上,每瓶接种410个。 接种后,瓶、管用无菌药棉或盖封口,培养皿用无菌胶带封口。 培养基大多应保持在25℃左右,但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。 外植体的增殖是组培的关键阶段,在新梢等形成后为了扩大繁殖系数,需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中,增殖培养基一般在分化培养基上加以改良,以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后,可视情况进行再增殖。 继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根,必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。 


练苗移栽:从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境,试管必须进行炼苗。一般移植前,先将培养容器打开,于室内自然光照下放3天,然后取出小苗,用自来水把根系上的营养基冲洗干净,再栽入已准备好的基质中,基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫,加强水分管理,保持较高的空气湿度(相对湿度98%左右),但基质不宜过湿,以防烂苗。


 

 组织培养的应用

 

植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域,除了在基础理论的研究上占有重要地位以外,还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。 


快速繁殖:用植物组织培养的方法进行快速繁殖(rapidpropagation)是生产上最有潜力的应用,包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物??旆奔际醪皇芗窘诘忍跫南拗?,生长周期短,而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽;通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽;通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。试管快速繁殖应用在下列生产或研究中:(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种,以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。(3)繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。由于组织培养周期短,增殖率高及能全年生产等特点,加上培养材料和试管苗的小型化,这就可使有限的空间培养出大量的植物,在短期内培养出大量的幼苗。组织培养突出的优点是,通过这一方法在较短时期内迅速扩大植物的数量,以一个茎尖或一小块叶片为基数,经组织培养一年内可增殖到10 000100 000株。


         植物脱毒:植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害,有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害,尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖,若蒙受病毒病,代代相传,越染越重,甚至会造成极严重的后果。自从Morell952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗(virus free)后,微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合,则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物,茎尖培养得到的植株难以发根生长,则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用,如马铃薯,甘薯,草莓,苹果,香石竹,菊花等。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心,这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究,形成了一个规范的系统程序,从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。 


变异和培育:植物组织培养过程中往往存在大量的变异,这种变异称为体细胞无性系变异。具有如下特点:一是变异的无方向性:既有有利的变异,也有有害的变异既有形态变异,也有生理变异。二是变异的普遍性:变异在组织培养中经常发生,出现在组织培养的各个时期。既有农艺性状变异,又有经济性状变异;既有表型变异,又有生理变异。三是植物体细胞无性系变异的类型:一类为可遗传变异,主要是由于遗传物质的变化引起的(尤以基因突变为主)。四是引起植物体细胞无性系变异的原因:高浓度的GAIAA,会造成畸形胚的高频发生,TDZ可使植株产生白化苗或玻璃化植株。五是植物体细胞无性系变异的利用价值及途径,对于育种有重要的应用价值。 


单倍体育种:花药、花粉的培养在苹果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20种园艺植物得到了单倍体植株。在常规育种中为得到纯系材料要经过多代自交,而单倍体育种,经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体,大大缩短了育种的世代和年限。


种质资源保存用植物组织培养技术保存种质具有以下优点:在较小的空间内可以保存大量的种质资源。具有较高的繁殖系数。避免外界不利气候及其他栽培因素的影响,可常年进行保存。不受昆虫、病毒和其他病原体的影响。有利于国际间的种质交换与交流。

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